Джастин Чэмберс родился 11-го июля 1970 года в Спрингфилде, Огайо, США. Джастин – один из пятёрых детей Джона и Пэм Чамберсов, ирландско-немецко-американской семье. У него есть брат-близнец Джейсон, ещё один старший брат и две старшие сестры. Во время отдыха в Париже на него обратил внимание моделинговый скаут, благодаря которому Джастин некоторое время работал моделью в рекламных капаниях у Кельвина Клайна, Джорджио Армани и др. по всей Европе, Японии и США. В девяностых годах он обосновался в Нью Йорке, где 4 года учился в H.B. Studios. Эта студия дала ему возможность засветиться во многих сценических постановках и нескольких телевизионных ролях.

Первый прорыв пришёл в 1995 году – четырёхмесячная работа в долгоиграющей мыльной опере на NBC "Другой мир" ("Another World"). Затем он сыграл вместе с Лолитой Давидович в сериале "Огненная жатва" ("Harvest of Fire") и с Дженнифер Гарнер в сериале "Роуз Хилл" ("Rose Hill"). На большом экране Джастин дебютировал в драме Барри Левинсона «Высоты свободы» ("Liberty Heights") в 1999 году. Затем пришли роли в таких фильмах, как "Мушкетёр" ("The Musketeer"), "Свадебный переполох" ("Wedding Planner") и др.

В 2005 году Чэмберс начинает играть в сериале "Анатомия Грей" роль интерна – доктора Алекса Карева. Он также сыграл роль полицейского детектива в триллере "Зодиак".

С 1993 года Джастин счастливо женат на Кише Чэмберс с которой познакомился во время своей модельной карьеры. У этой семейной пары пятеро детей: Изобелла (Isabella) 1997 г.р., близнецы Майя и Кайла (Maya и Kaila) 1999 г.р., Ева (Eva) 2001 г.р. и Джексон (Jackson), рождённый в 2002 г. Сейчас счастливое семейство живёт в Лос Анджелесе, куда они переехали из Нью Йорка.